세가지 다른 현미경의 빠른 축 초점을 위한 구현 방법- 광시야, 공초점, 2광자 및 라이트 시트 현미경
Optotune
요약
큰 조리개, 빠른 응답 및 작동 시간, 우수한 광학 품질을 특징으로 하는 EL-10-30은 현미경의 다양한 응용 분야에 상당한 가능성을 제공한다. 이 애플리케이션 노트에서는 (1) 고전적인 광시야 형광 현미경, (2) 형광 공초점 현미경 및 (3) 2광자 현미경의 세 가지 다른 현미경 방법에서 빠른 축 초점을 위한 ETL(전기 가변 렌즈, electrically tunable lenses)의 구현에 대해 소개한다.
일반적인 고려 사항 및 구현
ETL은 현미경의 다양한 응용 분야에 사용할 수 있다. 여기에는 특수 조정 가능한 조명 시스템과 전기로 제어되는 줌 광학 장치 등이 포함된다. 이 애플리케이션 노트에서 우리는 독점적으로 광축을 따라 초점을 맞추기 위한 ETL의 사용에 대해 논의한다. ETL의 구현 및 광학 성능 요구 사항에 따라 30-700 마이크론의 축 초점 범위를 얻을 수 있다. 그럼에도 불구하고, 현미경 검사에서 ETL을 사용하기 위해 논의된 대부분의 기술 세부 사항은 다른 애플리케이션에도 적용된다.
표준 현미경에서 축 초점은 일반적으로 z-스테이지 또는 현미경 대물렌즈에서 표본을 이동하여 달성된다. 정확한 포커싱을 위한 일반적인 대안 솔루션은 피에조 작동 대물 마운트를 사용하는 것이다. 그러나 이러한 포커싱 기술은 시편에 대한 기계적 축 모션을 기반으로 한다. 광학 초점 방식을 사용하면 움직임이 없고 훨씬 더 빠른 초점을 구현할 수 있다. 광학 초점을 실현하는 편리한 솔루션은 현미경의 광학 경로에 ETL을 포함하는 것이다.
현대 현미경 대물렌즈는 무한 수정 광학(infinity-corrected optics)을 가지고 있다. 즉, 대물렌즈의 초점 평면 내의 한 지점에서 발생하는 빛이 이미지 평면 내의 한 지점에 초점을 맞추지 않고 대물렌즈에서 평행한 광선(무한 초점)으로 나오는 것을 의미한다. (그림 1). 디텍터(detector)에 실상을 형성하려면 추가 튜브 렌즈가 필요하다.
물체나 광원이 대물렌즈 전면 렌즈에 더 가까이 이동하면 대물렌즈는 발산 빔을 생성하는 반면, 물체가 공칭 작동거리보다 멀리 배치되면 수렴 빔이 생성된다. 이러한 조건은 반대로 생각할 수 있다. 조정 가능한 광학 구성 요소를 사용하여 대물렌즈에서 발산 또는 수렴 빔을 생성할 수 있는 경우 현미경은 광학 축을 따라 초점을 맞출 수 있다. 이것은 레이저 스캐닝 현미경처럼 대물렌즈를 통한 조명 및 이미징 광 경로 모두에 적용된다.
EL-10-30은 조정 가능한 수렴 빔만 생성할 수 있으므로 음의 초점 거리에서 양의 초점 거리까지 조정 범위를 달성하려면 음의 초점 거리의 오프셋 렌즈와 쌍을 이루어야 한다(그림 2).
여기서는 초점 거리가 -100mm인 평면 오목 싱글렛(concave singlets)을 EL-10-30(저분산 변형, 초점 거리 범위 50-200mm)과 결합했다. ETL과 Ol(오프셋 렌즈, offset lens)의 조합은 맞춤형 렌즈 홀더 또는 표준 30mm 렌즈 튜브에 장착할 수 있다.
광학 초점을 달성하는 가장 쉬운 방법은 ETL/OL 어셈블리를 가능한 한 대물렌즈에 가깝게 장착하는 것이다(그림 3). 예를 들어, ETL과 OL은 RMS 스레드가 두 개 있는 렌즈 튜브에 장착하고 대물 리볼버와 대물렌즈 사이에 삽입할 수 있다. 이는 압전 초점 장치가 삽입되는 것과 같은 방식이다.
ETL과 OL을 대물렌즈 후방 스톱 가까이에 배치하는 것은 간단하고 구현이 쉽지만 광학 초점을 맞추는 데 최적이 아닌 위치이며 모든 이미징 애플리케이션에 적합하지 않다. 대부분의 현미경 대물렌즈는 텔레센트릭이다. 즉, 각 번들의 중심 광선(예: 그림 3의 축상 광선, 빨간색)(주 광선이라고도 함)은 대물 렌즈를 떠난 후 광축을 따라 전파된다. 목표 가까이에 배치된 ETL로 초점을 맞추면 텔레센트릭이 아닌 조건이 발생한다(그림 4).
결과적으로 축 초점 위치가 변경되면 시야(FOV) 크기 또는 배율이 변경된다. 원하는 초점 이동이 작은 경우(<50미크론), 이는 허용될 수 있다. 또는 ETL/OL 어셈블리는 4f 릴레이 시스템(예: 두 개의 achromat으로 구성된 4f 시스템)을 통해 현미경 대물렌즈의 켤레 동공 평면에 위치할 수 있다. 대부분의 대물렌즈에는 접근할 수 없는 정지가 있기 때문이다(그림 5)
그러나, 대부분의 상업용 현미경은 릴레이 시스템을 광 경로에 삽입하는 것을 허용하지 않는다. 이 경우 릴레이 시스템을 카메라 또는 레이저 포트에 배치하는 것이 옵션일 수 있다.
EL-10-30 제어
EL-10-30은 레이저 다이오드용 정밀 정전류 드라이버(예: Edmund Optics NT56-804, Thorlabs LD1255R) 및 0-250mA 프로그래밍 가능 아날로그 출력을 사용하여 컴퓨터로 쉽게 제어할 수 있다.
간단한 포커싱 애플리케이션의 경우 제어 전류와 초점 위치를 관련시키는 보정된 룩업 테이블이면 충분하다(그림 15 참조).
두 가지 유형의 구현을 요약하면 다음과 같다.
적용 예: 광시야 현미경
시각적 사용의 경우 초점을 맞추는 동안 FOV 또는 배율의 변경이 혼동된다(시각적 모양이 확대/축소 효과에 해당하기 때문에). 이것은 작은 초점 증분(수 미크론)의 경우 허용될 수 있다. 그렇지 않으면 효과가 방해된다. 이 경우 ETL/OL 어셈블리를 켤레 동공 위치에 배치해야 한다.
대부분의 현미경에서 추가 릴레이 광학 및 ETL/OL 어셈블리가 포함된 맞춤형 모듈을 광학 경로에 삽입해야 한다. 일반적인 수직 현미경에서 정지 위치는 대물렌즈 내부에 있으며 접근할 수 없으므로 릴레이 시스템이 필요하다. 그러나 도립 현미경에서 공액 동공은 종종 현미경 본체 내부의 광학 장치에 의해 형성되며 이러한 현미경의 특정 유형에서는 이 동공에 접근할 수 있고 광학 경로의 수직 부분에 위치하므로 ETL 기반 포커싱 시스템의 삽입에 이상적이다. 그러한 현미경 중 하나는 그림 6에 스케치된 1980년대 Zeiss Axiovert 35이다.
설정
ETL/OL 어셈블리는 두 구성 요소를 30mm 렌즈 튜브에 삽입하고 광학 레일에 부착하여 동공 가까이에 배치한다(그림 8). 동공 위치를 파악하기 위해 간단한 트릭을 사용할 수 있다. 위상 현미경 검사에 사용되는 위상 마스크는 공액 동공 평면으로 다시 이미지화 된다. 콘덴서 또는 대물렌즈에서 위상 마스크의 선명한 이미지가 형성되는 위치는 ETL에 대한 이상적인 위치다(그림 8의 삽입).
이러한 유형의 ETL 기반 포커싱은 ETL을 광범위한 대물렌즈와 함께 사용할 수 있다는 추가적인 이점이 있다. 일부 유형의 대물렌즈는 동공 이미징 특성이 다르기 때문에 대물렌즈에 따라 ETL 및 OL의 최적 위치가 이동할 수 있다.
결과
40x NA 0.6 대물렌즈(Zeiss LD Achroplan 40x / 0.6 Korr Ph2)와 결합하여 최대 120미크론의 디포커싱 범위를 달성할 수 있다(수정 링이 고정된 위치에 설정됨). 꽃가루 그룹(에피형광 모드)의 ETL 초점으로 획득한 z 스택의 예시 이미지는 그림 9에 나와 있다.
적용 예: 공초점 현미경
가장 중요한 현미경 기술 중 하나는 세포 생물학, 단일 분자 물리학 및 기타 여러 분야에서 광범위하게 응용되는 공초점 현미경이다.
설정
표준 공초점 현미경은 광학 경로의 대부분에서 광학 장치에 접근하거나 광학 장치를 삽입할 가능성이 없는 고도로 통합된 시스템이다. 특정 현미경에 따라 ETL/OL 어셈블리를 삽입하는 다양한 솔루션이 가능하다. 한 가지 가능성은 공초점 이미징에 필터 큐브가 필요하지 않은 경우 현미경 스탠드의 필터 터렛에 있는 맞춤형 필터 큐브에 ETL/OL 어셈블리를 장착하는 것이다. 또는 ETL을 릴레이 시스템에 장착할 수 있다(그림 10).
여기 사용된 현미경1(그림 11)은 올림푸스 IX-71의 측면 포트에 부착된 공초점 장치(Yokogawa CSU X1)와 CCD 카메라가 있는 회전 디스크 공초점이다. 이 현미경 구성을 사용하면 현미경을 광범위하게 수정할 필요 없이 ETL 및 OL을 포함하는 수정된 원래 필터 큐브를 필터 터렛에 삽입할 수 있다. 작동하는 동안 필터 터렛을 빈 위치로 돌려 ETL을 광학 경로에서 제거할 수 있다.
결과
40x NA 1.3 대물렌즈(Olympus UPLFLN 40XO)와 결합하여 60미크론의 z 범위가 가능했다. 꽃가루 알갱이(직경 100미크론)의 z 스택 단일 조각이 그림 12에 나와 있다.
적용 예: 2광자 현미경(Two-photon microscopy)
산란 매체에서 뛰어난 이미징 기능으로 인해 2광자는 조직 내부 깊숙한 형광 이미징에 매우 적합한 기술이다.
신경 활동의 기능적 지표 및 생체 내 이미징 프로토콜과 결합된 2광자 현미경은 살아있는 마우스 뇌 내부 깊숙이 있는 10분의 1에서 수백 개의 뉴런으로 인구 활동을 기록하는 표준 방법이다. 뉴런은 볼륨 전체에 분포되어 있으며 단일 초점면을 샘플링 하면 로컬 네트워크에서 발생하는 전체 활동에 대한 힌트만 제공된다. 따라서 빠르고 간단한 3D 현미경 기술이 필요하며 ETL을 사용하면 매우 간단하고 직접적인 방법을 제공한다. 사실, ETL과 2광자 현미경은 다음과 같은 측면 때문에 이상적인 조합이다.
• 대부분의 2광자 현미경에서 축 방향 스캐닝은 여기 경로에서만 광학 초점 체계를 구현하여 달성할 수 있다. 이것은 초점에서만 형광단을 여기시킬 수 있는 2광자 현미경에 사용된 비선형 여기 과정 때문이다. 여기 빔을 수정하여 초점을 축 방향 및 측면으로 이동하면 3D 2광자 레이저 스캐닝 현미경 검사법에 충분하다.
• 여기 레이저는 850 nm의 현미경에서 NIR 파장에서 작동한다. 긴 파장은 가시 파장에서 이미지를 심각하게 저하시키는 파면 수차를 허용한다.
• 여기 레이저의 작은 스펙트럼 대역폭(10nm FWHM)은 비색수차 ETL/OL 조합으로 인해 발생할 수 있는 색수차의 영향을 제한한다.
• 기능적 세포 활동을 측정하는 대부분의 생물학적 응용 프로그램의 경우 대물렌즈 가까이에 장착된 ETL/OL 어셈블리에 의해 도입된 FOV 크기의 변화는 측정을 방해하지 않는다. 기능 데이터를 기록하려면 시간이 지남에 따라 레이저가 동일한 셀 세트를 반복적으로 가리켜야 한다. 배율 변경으로 인해 셀이 더 멀리 떨어져 있는 경우 해당 지점을 선택하여 스캔한다.
설정
맞춤형 2광자 현미경과 함께 사용되는 설정은 그림 14에 나와 있다.
결과
ETL의 초점 거리를 50~200mm로 조정하여 최대 700미크론의 축 초점을 달성했다. 결과적으로 대물렌즈의 working distance(명목상 3.3mm)가 2.8mm에서 3.41mm로 변경되었다. 대부분의 이미징 애플리케이션의 경우 훨씬 더 작은 범위로 충분하다.
적용 예: 검사 현미경
표준 렌즈 구성 요소를 사용하는 검사 현미경에서 가변 렌즈는 일반적으로 무한대 보정 대물 렌즈와 튜브 렌즈 사이에 배치된다. 다음 예에서는 EL-10-30-Ci와 Qioptiq의 Optem 미세 검사 렌즈를 결합한 기성품 시스템을 간략하게 설명한다. 모든 부품은 C-마운트 나사산을 제공하므로 서로 완벽하게 맞는다. 아래 표는 달성된 Z 범위 및 분해능을 간략하게 보여준다.
현미경 검사에서 ETL 사용: 체크리스트
• 빔 경로에서 ETL/OL 어셈블리를 어디에 삽입해야 하는지? 이 위치에 액세스할 수 있는지?
• 중력으로 인한 ETL 표면의 비대칭 형상을 피하기 위해 ETL/OL 어셈블리를 광학 경로 내에서 지면에 수직으로 배치할 수 있는지?
• 빔이 EL-10-30의 10mm 조리개에 맞도록 충분히 작은지? (이것은 공액 동공의 크기에도 적용된다.) 전기 초점이 필요하지 않은 경우 20mm 자유 조리개가 있는 Optotune의 수동 조정 가능한 렌즈 ML-20-35의 사용을 고려해야한다.
• 어떤 초점 범위를 달성해야 할지? 대부분의 경우 ETL을 사용한 광학 초점은 필요한 범위를 달성하기 위해 기계적 초점 장치로 보완되어야 한다. ETL은 중간에서 높은 NA 대물렌즈를 사용하여 10분의 1에서 수백 마이크론의 초점 범위에 적합한다. 저배율 low-NA 대물렌즈를 사용하면 1mm 범위가 가능한 것으로 보인다.
• 어떤 광학 성능 요구 사항을 유지해야 하는지? 예를 들어, 2광자 현미경에서 준 단색 근적외선 여기광은 색수차 및 기타 수차 수정에 대한 요구 사항을 완화하여 생체 내 이미징에 필요한 수백 미크론의 초점 범위를 생성한다. 반면에 일반적인 공초점 현미경은 광학 보정 측면에서 훨씬 더 높은 요구사항이 있지만 일반적인 시편 크기도 훨씬 작아(10분의 1 마이크론) 특정 응용 분야에 ETL을 성공적으로 적용할 수 있다. 전체 현미경의 광학 시뮬레이션을 통해 일반적으로 ETL 매개 초점을 필요한 요구 사항에 맞출 수 있다.
• 어떤 초점 속도를 목표로 할지? EL10-30을 사용한 빠른 초점 조정이 입증되었다 (40x NA 0.8 대물렌즈를 사용하여 15ms에서 100미크론의 초점 이동, 초점 거리가 108mm에서 82mm로 변경됨).
자료 제공: Optotune(www.optotune.com)
